PCR實驗是基于核酸水平的微觀樣本實驗，而這些微觀樣本對溫度、ph值等實驗環(huán)境非常敏感，在盡力維護樣本和保存環(huán)境的同時，防止核酸樣本污染也成為不可避免的話題。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，今天給大家簡單介紹一下PCR實驗室的主要污染來源、實驗中如何避免和減少污染的可能性及實驗發(fā)生污染的應(yīng)急處理方案。
一、PCR實驗室的污染來源
1、樣本間交叉污染：收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴散，相互交叉污染。
2、實驗試劑污染：在試劑配制過程中，摻入核酸模板導(dǎo)致污染。
3、擴增產(chǎn)物污染：大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋。
4、克隆質(zhì)粒污染：作為陽性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。
二、PCR實驗室的防污染方法
1、合理的實驗室分區(qū)：試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)和擴增區(qū)內(nèi)的實驗用品，包括移液器等器具應(yīng)專用，空氣、物品流向依次為：試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)，不可逆行。
2、清潔的實驗用品：實驗室自配試劑（去離子水、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應(yīng)管等實驗耗材應(yīng)一次性使用。
三、正確的實驗操作
1、實驗應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)進行，工作臺內(nèi)應(yīng)放置PCR專用的微量離心機、各量程的移液器和其他必須物品。
2、實驗的過程中選擇最合適尺寸的手套并能及時更換，在進出不同實驗區(qū)域或進行模板操作后都應(yīng)更換實驗服、口罩、帽子及手套，以避免不同實驗區(qū)交叉污染。
3、裝有PCR試劑的反應(yīng)管在打開之前應(yīng)先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風險。謹慎開啟反應(yīng)管，防止管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠導(dǎo)致污染。
4、吸加試劑和模板的操作應(yīng)嚴格按照規(guī)范要求進行，遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產(chǎn)生的交叉污染。
5、PCR試劑建議小量分裝，以減少反復(fù)凍融、重復(fù)取樣次數(shù)。多樣本PCR反應(yīng)時，先配制反應(yīng)混合液分裝至反應(yīng)管中，最后加入樣本核酸，請勿同時開蓋，盡量保證單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作。
6、實驗試劑應(yīng)與樣品和PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同處。
7、PCR擴增實驗完成后及時將反應(yīng)管取出，用一次性手套將產(chǎn)物反應(yīng)管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。
四、規(guī)范的實驗設(shè)計：應(yīng)遵循實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定，實驗中設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照，全程質(zhì)控實驗過程，驗證PCR反應(yīng)的可靠性，并協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。
五、PCR實驗室的污染應(yīng)急處理方法
1、若核酸樣本溢出：應(yīng)立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑，約30分鐘后，清除污染物品，再用次氯酸消毒劑擦拭，并用75%酒精噴灑，移動紫外車定點照射1小時。
2、其他不明情況污染：應(yīng)暫停所有實驗操作，清理實驗室內(nèi)所有物品，尋找污染來源。同時加大實驗室的通風，對實驗室內(nèi)所有表面（臺面、地面及墻面） 進行消毒，用75%酒精空中噴霧。開啟紫外消毒裝置，延長紫外照射時間（4小時以上）。以上措施每日進行，直至污染消除；用新試劑及確認無污染的器材進行原污染項目的試劑空白檢測，連續(xù)3次均陰性后方可進行常規(guī)檢測。
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